Mutaties

Introductie

Bij vrijwel alle Duchenne patiënten wordt een mutatie gevonden in het gen dat de genetische code van het dystrofine eiwit bevat. Er zijn echter verschillende typen mutaties. Het gevolg van deze mutaties is hetzelfde: er kan geen functioneel dystrofine worden gemaakt (zie de uitleg over exon skippen). Voor een aantal therapieën (exon skippen en PTC124) maakt het echter wel degelijk uit wat voor mutatie er in het gen aanwezig is, omdat ze niet voor alle mutaties werken. Ik zal hier beschrijven welke soort mutaties er voornamelijk worden gevonden in het dystrofine gen. Hoe de mutatie specifieke therapieën toepasbaar zijn voor bepaalde mutaties wordt hier uitgelegd.

Van gen naar eiwit

Genen bevatten de blauwdruk (genetische code) voor eiwitten. Genen bestaan uit DNA en zijn verdeeld over 23 paar chromosomen, die zich in de celkern van alle cellen van ons lichaam bevinden. De eiwit fabriek (het systeem dat de genetische code vertaald naar eiwitten) bevindt zich buiten de kern in het zogenaamde "celplasma". Omdat de genen dus fysiek gescheiden zijn van de "eiwit fabriek", wordt van genen waar eiwit van moet worden gemaakt een tijdelijke kopie gemaakt. U kunt dit vergelijken met een recept dat u nodig hebt uit een kookboek dat niet uit de bibliotheek (celkern) mag worden meegenomen. Om het recept toch thuis (celplasma) te kunnen maken, maakt u een kopie die u meeneemt naar huis. De kopie van een gen bestaat uit RNA en wordt de kern uit getransporteerd naar de eiwit fabriek waar het RNA kan worden omgezet in eiwit.

De genetische code ligt echter verspreid over een gen in zogenaamde exonen. Tussen de exonen liggen intronen, die geen eiwit informatie bevatten. Voor het RNA naar de eiwit fabriek kan, moeten deze intronen worden verwijderd en de exonen aan elkaar worden geplakt (Figuur 1). Dit gebeurt in de celkern tijdens een proces dat "splicing" heet. Na de splicing ontstaat een RNA dat alleen de genetische code bevat (boodschapper of "messenger" RNA (mRNA)). Dit boodschapper RNA wordt vertaald in eiwit.

Figuur 1. De genetische code ligt verspreid over exonen, die worden onderbroken door stukken DNA die geen eiwit informatie bevatten (intronen). Er wordt eerst een RNA kopie gemaakt van het hele gen, waar vervolgens tijdens de splicing de intronen uit worden verwijderd en de exonen aan elkaar worden gezet. Het resulterende boodschapper RNA bevat de genetische code van een eiwit en kan worden vertaald door de eiwit fabriek. Het dystrofine gen heeft 79 exonen.

Bij de vertaling van RNA naar eiwit, worden steeds drie RNA bouwstenen vertaald in een eiwit bouwsteen. In figuur 2 staat een vereenvoudigd voorbeeld.

Figuur 2. De vertaling van boodschapper RNA (mRNA) gaat steeds per drie RNA bouwstenen. De vertaling begint altijd met een "start" code voor een start eiwit bouwsteen. Deze is hetzelfde voor ieder eiwit. Daarna volgen de codes voor andere eiwit bouwstenen (aminozuren). In dit eenvoudige voorbeeld zijn dit twee verschillende bouwstenen (de blauwe en de gele), maar er zijn in werkelijkheid meer dan twintig eiwit bouwstenen. Eiwitten zijn opgebouwd uit tientallen tot honderden en soms wel duizenden bouwstenen. Het dystrofine eiwit bestaat bijvoorbeeld uit 3685 bouwstenen. Aan het einde van het boodschapper RNA zit een stop signaal, dat aangeeft dat het eiwit "af" is. Omdat de bouwstenen verschillende eigenschappen hebben (groot of klein, wel of niet oplosbaar in water, wel of geen electrische lading etc), wordt de eigenschap van een eiwit uiteindelijk bepaald door de hoeveelheid en eigenschappen van de eiwit bouwstenen.

Mutaties

We hebben gezien dat genen de blauwdruk bevatten voor eiwit. Wanneer er een fout zit in een gen (mutatie) heeft dit dus gevolgen voor het eiwit product. Duchenne patiënten kunnen geen dystrofine meer maken omdat hun dystrofine gen gemuteerd is. De drie type mutaties die het meeste voorkomen bij Duchenne patiënten zijn deleties (het verdwijnen) van een of meerdere exonen, duplicaties (het verdubbelen) van een of meerdere exonen en kleine mutaties (ook wel "punt mutaties" genoemd).

Deleties

De meeste (65%) Duchenne patiënten hebben een deletie van een of meerdere exonen (zie Figuur 3).

Figuur 3. Een deletie in het dystrofine gen. Een normaal dystrofine gen heeft 79 exonen die worden onderbroken door intronen. Bij sommige patiënten mist een deel van het gen (in dit voorbeeld exon 48, 49 en 50). In dit geval begint de deletie na exon 47 (in intron 47) en eindigt na exon 50 (in intron 50). De deletie omvat dus een deel van intron 47, exon 48, intron 48, exon 49, intron 49, exon 50 en een deel van intron 50. Omdat alleen de exonen de genetische code voor het eiwit bevatten, wordt een deletie in de regel aangeduid met welke exonen er missen: in dit geval dus een deletie van exon 48-50.

Door de deleties van Duchenne patiënten gaat de genetische code verloren (in Figuur 3 passen exon 47 en exon 51 niet op elkaar). De gevolgen hiervan zijn desastreus (Figuur 4).

Figuur 4. De gevolgen van een verbroken genetische code. Bovenaan is het originele RNA en eiwit uit Figuur 3 te zien. In de onderste figuur is de genetische code verbroken (of verschoven) (hier door het verdwijnen van twee RNA eiwit bouwstenen). Omdat steeds drie RNA bouwstenen de code bevatten voor één eiwit bouwsteen zijn de gevolgen van deze verschuiving groot. In plaats van blauw-geel-geel, is de code nu geel-blauw-geel. Ook alle volgende codes zijn verschoven en na de mutatie worden de verkeerde eiwitbouwstenen ingebouwd (groen en oranje in plaats van blauw en geel). Aangezien de functie van een eiwit wordt bepaald door de bouwstenen, is een eiwit dat wordt opgebouwd uit verkeerde bouwstenen niet functioneel (ter vergelijking: het is onmogelijk om met een bouwpakket voor een vliegtuig een goede, functionerende auto te bouwen).

Duplicaties

Een klein deel van de Duchenne patiënten (7%) hebben een duplicatie van een of meerdere exonen (zie Figuur 5).

Figuur 5. Een duplicatie in het dystrofine gen. Een normaal dystrofine gen heeft 79 exonen die worden onderbroken door intronen. Bij sommige patiënten is een deel van het gen verdubbeld (in dit voorbeeld exon 48, 49 en 50). Ook bij duplicaties zijn zowel de exonen als de intronen verdubbeld, maar worden alleen de exonen genoemd in de duplicatie: in dit geval dus een duplicatie van exon 48-50.

Het gevolg van duplicaties is hetzelfde als bij deleties: de genetische code wordt verbroken (zie Figuur 6). In Figuur 5 is te zien dat exon 48 niet past op exon 50.

Figuur 6. Verbreken van de genetische code door een duplicatie. Bovenaan is weer het originele RNA en eiwit uit Figuur 3 te zien. In de onderste figuur is de genetische code verbroken (of verschoven) (hier door het verschijnen van twee RNA extra eiwit bouwstenen). Ook hier zijn de gevolgen van deze verschuiving groot: na de mutatie worden de verkeerde eiwitbouwstenen ingebouwd. Ditmaal gaan het om andere bouwstenen dan bij de deletie (Figuur 4), maar het zijn wederom niet de blauwe en licht-gele die nodig zijn voor de eiwit functie.

Kleine mutaties

Iets meer dan een kwart van de Duchenne patiënten (28%) hebben een kleine mutatie. Hierbij zijn alle exonen gewoon aanwezig, maar is een van de bouwstenen van het DNA (en dus het RNA) veranderd (Figuur 7). Door deze verandering ontstaat er een vroegtijdig stop signaal, zodat het eiwit niet afgemaakt kan worden.

Figuur 7. Bij een puntmutatie is één van de DNA bouwstenen veranderd. Aangezien de RNA kopie is gebaseerd op het DNA origineel, zal het RNA ook deze fout bevatten. In het voorbeeld is een blauwe bouwsteen veranderd in een rode. De blauwe bouwsteen vormde het begin van de blauw-geel-geel code, die wordt vertaald in een blauwe eiwit bouwsteen. Echter, de rood-geel-geel code is een "stop signaal". In plaats van een blauwe eiwit bouwsteen stopt de vertaling dus vroegtijdig. Het gevolg is dat er geen goed eiwit gevormd kan worden, aangezien de helft van de eiwit bouwstenen niet aanwezig is.

Naast puntmutaties, kan het ook gebeuren dat één of twee DNA bouwstenen verdwijnen of extra worden toegevoegd in een exon. Dit heeft een verschuiving van de genetische code tot gevolg (net als bij een deletie of duplicatie).

Ten slotte kunnen kleine mutaties ook de splicing (het samenvoegen van alle exonen) verstoren. Het begin en einde van alle intronen bestaan uit een bepaalde combinatie van bouwstenen, die herkend worden door de splicing machine (Figuur 8). Wanneer een van deze bouwstenen verandert zal een exon niet meer herkend worden en kan de genetische code worden verstoord (Figuur 9 en 10).

Figuur 8. Tijdens het proces van splicing worden de intronen verwijderd en de exonen aan elkaar gezet. De splicing machine die verantwoordelijk is voor dit proces herkent de laatste en eerste twee bouwstenen van een intron ("splice sites"). Alle intronen eindigen met een gele en een groene bouwsteen, terwijl alle intronen beginnen met een groene en een rode bouwsteen.

Figuur 9. Een verandering van een bouwsteen in een splice site (de laatste twee bouwstenen van een intron, of de eerste twee bouwstenen van een intron) verstoord de herkenning van een exon. In het voorbeeld is de geel-groen code veranderd in een geel-rood code. Dit wordt niet herkend.

Figuur 10. Het gevolg van een mutatie in een "splice site". Bij het tweede exon is een bouwsteen veranderd (zie figuur 9), waardoor het exon niet meer goed wordt herkend (het exon lijkt meer op een intron dan een exon). Het gevolg is dat bij het aan elkaar zetten van alle exonen, dit tweede exon wordt overgeslagen. Dit verstoort de genetische code (de overgebleven exonen passen niet goed op elkaar).